Lökosit Tanımlaması

Ejakulatta görülen lökositlerin büyük çoğunluğunu nötrofiller oluşturur. Bu hücrelerin ejakulatta normalden fazla görülmesi (lökospermi), üreme organlarında bir enfeksiyon varlığını düşündürür. Normal bir ejakulat 5×10⁶/ml yuvarlak hücre ve 1×10⁶/ml lökositten daha fazla hücre içermemelidir. Lökosit tarama testi, nötrofilik polimorf lökositleri diğer hücrelerden ayırmak sureti ile üreme kanallardaki enfeksiyon taramasında kullanılır. Semen örneğinde gözlenen lökosit hücresinin diğer hücrelerden ayırt edici özellikleri şunlardır:

Diğer hücrelerle karşılaştırıldıklarında daha sabit ölçülerininin olduğu gözlenir.
Germinal hücrelerden küçüktürler.
Nükleusları arasında bağlantı vardır.
Nüklear bölgenin sitoplazmik bölgeye oranı diğer hücrelerden fazladır.

Merkezimizde bu amaçla hazır kitleri kullanılmaktadır. Leuco Screen semen örneğindeki yapısal farklılıklar gösteren yuvarlak hücrelerin tanımlanmasında kullanılan peroksidaz boyama yöntemidir. Lökosit sayısının normalin üzerinde gözlendiği semen örneklerindeki sperm parametreleri etkilenmektedir. 1×10⁶ ve üzerinde lökosit saptandığında, aksesuar bez enfeksiyonu yönünden mikrobiyal testlerin yapılması gerekir. Çok yönlü lökosit üretiminin olduğu durumlarda reaktif oksijen radikalleri artarak sitotoksik sitokinlerin salgılanmasına neden olacağından fertilite olumsuz yönde etkilenebilmektedir.

Leucoscreen Çalışma Solüsyonunun Hazırlanması

1ml solüsyon-1’e 30 µl solüsyon-2 eklenir. Bu solüsyon bir gün süresince kullanılabilir.
Bir damla (10 µl) sperm ve bir damla (10 µl) çalışma solusyonu lam üzerinde lamelin

köşesiyle 1 dakika süresince karıştırılır.

Baloncukların oluşmasını engellemek için lam lamelle 2 dakika sonra kapatılır. Peroksidaz reaksiyonundan dolayı küçük baloncukların oluşması doğaldır. Peroksidaz pozitif hücreler arttıkça daha fazla baloncuk oluşur.
Hücreler 2 dakika sonra 400 büyütmede gözlenir. Sarı ile kahverengi arası boyanmış

hücreler, peroksit pozitif hücreler yani nötrofilik polimorf lökositlerlerdir. Pembe boyanmış

hücreler ise peroksidaz negatif olan diğer hücrelerdir.

Enfeksiyondan şüphenilen örneklerde izlenilenecek tek yol ise bakteriel kültürlerin oluşturulmasıdır. Steril loop yardımı ile kanlı agar mediumuna seminal plazmanın ekimi yapılır. Aerobik ve fakültatif anaerobik bakteri ekimleri %5’lik CO₂ altında, anaerobik bakteri ekimleri ise anaerobik ortamda, 37^oC’de 48 saat inkübe edilir. Daha sonra oluşan koloniler, hazır boyama kitleri kullanılarak tanımlanır. Aerobik ve fakültatif anaerobik bakteriler Streptex, Staplase, API 20E ile anaerobik bakteriler ise Mastring ID kit ile tanımlanabilmektedir. Difteroidler ve E. Coli direk olarak kültürden tanımlanır. Gözlenebilen her bir koloninin 103/ml bakteriye karşılık geldiği kabul edilir. Patojenik olmayan organizmalar için 104/ml (S.epidermidis, non-hemolitik streptokok, difteroidler ve -hemolitik streptokok); potansiyel patojenik organizmalar (E.coli, -hemolitik streptokok, anaeroblar, proteus) için ise 103/ml bakterispermi klinik olarak anlamlı kabul edilmelidir. Koloni sayımının 100 olması, klinik olarak önemli bir değeri ifade etmektedir.

Genital mikoplazma araştırması amacı ile Mycofast “All-In” hazır kiti kullanılabilir. Mikoplazma sayımı için 104/ml değeri önem taşır. Enzim immunoassay yöntemi ile de klamidya analizi yapmak mümkündür. Antibiyotik katkılı kültür mediumları kullanılmadığı takdirde, seminal kontaminasyonların fertilizasyon oranını ve embriyo gelişimini etkilediği bilinmektedir. Hem koloni gelişimi hem de lökoscreen test (+) gözlendiği takdirde, üretral swab ve prostatik masaj uygulanabilir.

Germinal İmmatür Hücre Tanımlaması

Seminal plazmada rastlanan immatür germ hücreleri polimorfonüklear lökositlerden tek veya çift olarak gözlenen yuvarlak nükleusları, değişik büyüklüklerde olmaları, nükleus/sitoplazma oranının daha düşük olmasıyla, intrasellüler peroksidaz olmamasıyla ve lökosit spesifik antijenlerin yokluğu ile ayırt edilirler. Peroksidaz testine negatif cevap verirler. Bir semen örneğinde immatür hücre sayısının 5×10⁶/ml ve altında olması beklenir. Bryan-Leishman boyaması ile ve hazır boyalı lamlardan oluşan Test-simplet kiti ile (Boehrilger, Mannheim) tanımlama yapmak mümkündür. Seminal plasmadan yaklaşık 5ml’lik miktar, hazır boyalı lama damlatılıp üzeri lamelle kapatılır. İmmersion oil ile 100X objektif yardımıyla ayrıntılı inceleme yapılır.

Eritrosit ve Epitel Hücre Tanımlaması

Kırmızı kan hücrelerinin seminal plazmada görülmesi durumunda makler kamara ile sayımlarının yapılması gerekir. Eritrositler, küresel yapıda, içe basık görünümlü, yaklaşık 7-8 mm yarıçaplı hücrelerdir. Masturbasyon işlemi sırasında penis ve elde oluşabilecek kanamalarda seminal plasmaya kırmızı kan hücreleri karışabilmektedir. Benzer şekilde kontaminasyona neden olabilecek epitel hücreleri ise diğer hücrelerden çok daha büyük olmaları ve flu görüntüleri ile ayırt edilebilirler.