Mikroenjeksiyon İşlemi (ICSI):
ICSI petrisi hazırlığı:
İşlemden en az yarım saat önce ICSI dishi hazırlanır.1 gün önce 37 C etüvde saklanan 10 adet 8µl’lik oositlerin konacağı droplar hazırlanır. Ayrıca spermlerin hızlarını yavaşlatacak 1 adet 8 µl’lik pvp drobu hazırlanır.Spermlerin konacağı 20 µl’lik sperm drobu yayılarak hazırlanır. Üzeri 4 ml 37 C deki parafin oil ile kapatılır.
Hazırlanmış olan sperm örneği uzun droba sperm yoğunluğuna göre yayılır petrinin kapağı sıkıca kapatılarak 37 C etüve kaldırılır.
ICSI işleminden hemen önce mikropipetler pipet tutuculara takılır.
Mikropipet uçları zemine paralel olacak şekilde mikroskop altında ayarlanır.
Mikroenjeksiyon işlemi invert mikroskopun ısıtıcılı(37 C) tablası üstünde yapılır.x400 büyütme kullanılır.Mikroskop hava akımı ve kapıdan uzak,vibrasyonu önleyen masa üstünde yapılır.
Olguların dosyaları tekrar gözden geçirilir.İnfertilite nedeni,daha önce mikroenjeksiyon yapılıp yapılmadığı,yapıldıysa fertilizasyon oranı,elde edilen embriyo sayısı ve kalitesi gözden geçirilir.Sperm parametreleri değerlendirilir.
Hyase işleminden sonra matürasyonu değerlendirilen oositler(Şekil 1-a GV oosit,1 –b M 1 oosit,1-c M2 oosit) matürasyon durumuna göre hemen yada 1-2 sa sonra ICSI işlemine alınır.ICSI işlemi M 2 oositlere yapılır.
ICSI dishindeki droplara tek tek oositler yerleştirilir.
Morfolojik olarak normal görünümlü ve varsa motil spermler seçilir ve ardından immobilize edilir.Çünkü motil spermlerin immobilize edilmiş spermler kadar iyi fertilizasyon sağlamadığı bilinmektedir.
ICSI dishindeki pvp drobundan mikroenjeksiyon pipetine biraz pvp çekilir.Spermler droplarından mikroenjeksiyon iğnesiyle pvp drobuna aktarılarak hareketlerinin azalması sağlanır.İmmobilizasyon işlemi pvp drobunda mikroenjeksiyon pipetinin uç kısmı ile spermin kuyruğunun orta kısmına dokunarak yapılır.
İmmobilize edilmiş spermin kuyruk kısmı önce ve düz olacak şekilde yakalanarak pipet içine alınır.
İlk oosit drobuna gidilir.Oosit holding pipet ile polar body 6 yada 12 hizasında olacak şekilde tutulur.
Mikroenjeksiyon pipeti 3 hizasına getirilir ve oolemmanın dış çizgisi ile aynı düzlemde olması sağlanır.
Sperm yavaşça pipetin uç kısmına getirilir ve zona pellusida delininceye kadar aspirasyon yapılmaksızın itilir.Oosit sitoplazması içine ulaştırıldığında yavaşça aspirasyon yapılır.
Oolemmanın pipet içine yavaşça dolması ve spermin geriye doğru hareketlenmesi oolemma membranının aşıldığını gösterir.Daha sonra yavaçca aspire edilen sitoplazma ve sperm geri verilir.Bu esnada pipet içindeki pvp’nin oosit içine verilmesinden kaçınılır ve yavaşça oositten çıkılır.
Bu işlem tüm oositlere aynı şekilde uygulanır.
İşlem esnasında oosit ve sperm morfolojisi kayıt edilir.
Mikroenjeksiyon sonrası oositler sırayla dropletlerden alınarak bir gün önce hazırlanmış kültür mediumuna aktatılır ve inkübatöre kaldırılır.